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某公司年產15000噸基因重組纖維素酶系列產品項目資金申請報告

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一、項目建設的意義和必要性

    1、國內外現狀及技術發展趨勢

    20世紀70年代以來,市場這只“看不見的手”使傳統的工業文明達到了鼎盛時期。工業化在創造傳統工業文明的同時,也對現代經濟社會發展的生態基礎造成了根本性的破壞,資源、環境和生態危機日益嚴重,其直接原因是18世紀以來造成人與自然尖銳對立的非持續的工業生產技術,其本質在于單純的市場調節已無力減少技術發展的邊際外部費用遞增趨勢。

    生物技術革命將促使有害生態環境的技術向無害化并能保護生態環境的方向發展,從而引起了社會生產技術體系的變化和飛躍。生物技術創新及其產業化,將為人類社會創造新的、更高水平的文明開辟了廣闊的空間。運用生物工程技術,將使經濟發展投入的資源少,利用率高,產出的產品或服務多,廢棄物少,因此,人類將對生物工程技術產品的需求也將不斷增加,生物技術在產業結構調整中的作用也將不斷提高,生物工程技術創新將日益被重視,生物技術產品的市場將越來越廣闊。

    生物酶制劑作為現代工業不可或缺的催化劑,主要技術一直為西方發達國家所壟斷,尤其是高活力的纖維素酶,基因重組工程菌株一直被丹麥諾維信和美國杰能科等少數西方發達國家的企業所壟斷,我國迄今為止尚無使用基因重組工程菌株進行產業化生產的企業。構建具有自主知識產權的基因重組纖維素酶工程菌株,生產高活力、熱穩定性好的纖維素酶是目前我國酶制劑行業的發展方向,因此,國務院辦公廳頒發《生物產業發展“十一五”規劃》(國辦發[2007]23號)明確強調支持纖維素酶和半纖維素酶基因工程菌株技術開發及產業化應用,也是國家科技部科技支撐計劃“生物技術產品中試與規模化生產配套技術與工藝的研究與示范”重點支持項目。

    2、基因重組纖維素酶項目對相關產業發展的作用與影響

    2.1 提升酶制劑行業整體水平

    由于該項目是我國酶制劑行業第一個采用具有自主知識產權的工程菌株進行產業化生產的項目,因此,對提高我國酶制劑行業和國外企業的競爭能力,提升行業整體水平具有積極意義。

    2.2 提高用戶產品質量、降低生產成本

    采用該項目產品,對提高我國紡織行業、飼料行業、中藥行業產品質量,降低生產成本,增強產品的市場競爭能力具有重要作用。

    3、該項目對關聯產業的影響

    3.1 促進非糧燃料酒精盡快實現產業化,化解能源危機,保障糧食安全

    近年來,由于能源緊缺和技術手段的缺乏,我國不得不以糧食作為原料生產燃料酒精,但是由于保障糧食安全的需要,發展非糧燃料酒精是現階段解決能源短缺的必由之路。秸稈燃料酒精的產業化生產,必須使用纖維素酶,因此,該項目的產業化是非糧燃料酒精產業化生產的關鍵因素之一,非糧燃料酒精的產業化對緩解能源危機、保障糧食安全具有重要的戰略意義。

    3.2 推動農業產業結構的調整

    該項目生產的主要原材料是秸稈,由于原料在產地必須進行初發酵,因此,在農村將產生新的初發酵行業,同時,基因重組纖維素酶面市后,在農村還將產生以纖維素酶作為催化劑,生產秸稈糖化飼料的發酵企業。因此,該項目對地方農業產業結構調整,加快社會主義新農村建設,拉動農民致富,加快農村小康社會進程具有積極意義。

    3.3 推動地方經濟的發展

    吉林市地處邊疆近海省,自然環境優越,是我國最具魅力的城市之一,是福布斯排行榜評價最適合發展工業的城市,是吉林省玉米,水稻的主要產區之一。但是,吉林市經濟發展不平衡,缺少生物工程高新技術項目。引進生物工程高新技術企業,扶持地方農業產業化龍頭項目是吉林市經濟發展的重大舉措之一,因此,該項目成為吉林市政府和吉林高新技術產業開發區重點招商引資項目。

    3.4 有利于資源再利用、發展循環經濟、提高資源經濟價值

   玉米及其它糧食秸稈多年以來一直作為廢棄物或燃料,其經濟價值幾乎趨于零。基因重組纖維素酶項目采用的主要原料是玉米秸稈。這一資源是可再生資源,經過粗加工,每噸玉米秸稈價格可以達到600—900元,而制成纖維素酶,以粗加工的秸稈為基數,每噸秸稈產生的價值可提升十倍左右,提高了資源利用率,提升了資源的經濟價值。

    4、市場分析

    該項目產品的主要應用領域為飼料、麻棉紡織、制藥、生物發酵等行業,該項目產品是上述行業產品生產過程中不可或缺的添加劑。

    據不完全統計,國內市場纖維素酶年需求大約12萬噸以上,05年至06年該類產品年需求增幅為38%;國際市場年需求大約40萬噸,主要集中在歐美地區,占國際市場總消耗量的70%,而且需求量正在以每年8%的速度增長。此外,除燃料酒精行業外,用戶直接使用的是復合酶,纖維素酶在復合酶中添加比例一般為80%左右,因此,纖維素酶市場需求量的統計一般以復合酶用量為依據。復合酶年用量統計如下(詳見附件):

    4.1 飼料行業:我國年產飼料1億噸左右,按每噸飼料添加0.5公斤復合酶計算,年復合酶用量約為5萬噸左右,其中纖維素酶添加量為4萬噸左右。

    4.2 麻棉紡織行業:我國洗滌復合酶年用量2萬噸左右,其中纖維素酶添加量為1.6萬噸左右。

    4.3 啤酒行業:我國年產啤酒3500萬噸左右,需大麥或小麥160萬噸,按每噸添加1.5公斤計算,啤酒復合酶年用量2.4萬噸左右,其中纖維素酶添加量為2萬噸左右。

    4.4 燃料酒精行業:該行業為纖維素酶潛在的巨大市場。目前我國年產燃料酒精160萬噸,預計2020年年產量將達到800—900萬噸。纖維酶是生產非糧燃料酒精必須使用的催化劑,按每6噸原料生產1噸燃料酒精計算,預計2020年,秸稈等非糧原料年用量最少4800萬噸,纖維素酶投料比按每噸原料3‰計算,年需求量將達到14萬噸左右。

    4.5 產品銷售

    酶制劑生產廠家一般不直接面對終端用戶,只面對銷售代理商。因此,我公司現階段只向相關代理商銷售產品并已簽訂了意向協議,相關情況如下:

    國內銷售:我公司已經和最大的銷售商夏盛集團簽訂了意向銷售合同,夏盛集團還出具了產品包銷承諾書及該公司和用戶簽訂的銷售合同及供貨計劃。

    產品出口:我公司正在和杰能科公司、嘉吉公司進行接洽,公司經營副總曾任杰能科公司技術負責人,熟悉國外市場,產品出口前景廣闊。

    5、與國家高技術產業化專項總體思路、原則、目標等關聯情況

    該項目屬于生物技術類,是國務院辦公廳《生物產業發展“十一五”規劃》(國辦發[2007]23號)微生物技術專項重點支持項目;是國家科技部科技支撐計劃“生物技術產品中試與規模化生產配套技術與工藝的研究與示范”重點支持項目;該項目2007年已經列入吉林省科技發展計劃,分別被評為重大和重點項目并獲得省長基金支持;該項目是地方農業產業化龍頭項目,是國債資金重點支持的項目。

二、項目技術基礎

    1、項目成果來源及知識產權情況

    1.1 某公司與中國科技大學易元生物技術有限公司合作,取得了基因重組纖維素酶原始菌株構建技術和菌株的使用權(詳見附件《專利的專有技術使用合同》)。

    1.2 由某公司提供原始菌株、菌株構建技術及工藝方案,與吉林農業大學合作,取得了基因重組纖維素酶第二代工程菌株及菌株構建技術的所有權(詳見附件《技術合同》)。

    2、已完成的研究開發工作及中試情況和鑒定年限

    2.1 本項目已完成基因重組纖維素酶工程菌株構建,該菌株現保存于吉林農業大學食品科學與工程學院實驗室深凍冰箱中。

    2.2 2008年初已經在吉林農業大學完成了中試,中試結果與實驗室試驗結果一致(詳見吉林農業大學生化實驗室《檢測報告》)。

    2.3 中試及小規模生產樣品已交付用戶使用,用戶已出具使用報告(詳見《寧夏夏盛果汁果酒酶有限公司傳真函》)。

    2.4 某公司技術專家已經針對基因重組纖維素酶生產工藝條件開發了連續發酵等生產工藝。此外,公司技術專家有十年以上纖維素酶生產經驗,已經掌握了成熟的纖維素酶生產工藝,因此,可以實現產業化生產。

    2.5 公司專家已經設計了纖維素酶系列產品生產線,主體設備及內部構件和管路連接已經完成。配套設備及GMP裝飾工程完工后即可投入生產。

    2.6 必要的說明。纖維素酶工程菌株的構建采用的是國際前沿的生物工程技術及基因打靶技術,但是,酶制劑生產工藝是公知技術。此外,生產過程的發酵條件優于實驗室條件,因此,只要中試設定條件與生產工藝條件一致,那么,所生產出來的產品性能將優于中試。

    3、技術或工藝特點以及與現有技術或工藝比較所具有的優勢

    3.1 技術原理

    3.1.1 纖維素酶

    自然界中纖維素的降解需要內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。纖維素降解過程首先被外切纖維素酶的CBD吸附到不溶性纖維素表面,使結晶結構的纖維素長分子鏈開裂,聚集結構解聚,長鏈分子末端部分發生游離從而為纖維素水解酶類的作用提高了可及性和反應性,從而使纖維素易于水化;之后內切酶作用于經外切活化的纖維素,分解其β-1,4鍵,產生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖。在內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶的協同作用下,纖維素的β-1,4糖苷鍵逐步水解,形成纖維寡糖和葡萄糖。其催化機理與溶菌酶相似,糖苷配基的脫去涉及2個保守羧基氨基酸分別作為質子供體和親核試劑執行酸堿催化的雙置換反應;谷氨酸位于細菌和真菌CBH,EG及葡萄糖苷酶的活性位點。協同作用其作用順序不是絕對按各酶的功能也不是簡單固定的。CBH和EG都能引起纖維素的分散和脫纖化,因此纖維素的結晶結構被打亂導致變形,使纖維素酶能深入纖維素分子界面之間,從而使纖維素孔壁、腔壁和微裂隙壁的壓力增大,水分子的介入又使纖維素分子之間的氫鍵被破壞,產生部分可溶性的纖維的微結晶,利于進一步降解。

    3.1.2 基因的同源重組技術

    基因的同源重組技術(homologous recombination),又稱基因打靶(gene targeting),指外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組并整合在預定位點上,從而改變細胞遺傳特性的方法。

    根據重組后靶基因的特征可以分為兩種類型:

    ①由于外源序列的引入或部分取代,靶基因原有結構被破壞,此即為基因破壞或剔除;                   

    ②靶基因的全部序列為新的基因所取代。這一新興技術已被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法,從理論上講它將使人類能按設計對極其復雜的細胞基因組結構進行定點、定量的改變,從而定向的改變細胞的遺傳結構和特征。

    同源重組技術的特點為:

    ①同源重組技術能把外源基因引入染色體DNA的特定片段上,在設計合理的情況下,同源重組技術可對宿主細胞染色體基因進行精細的改造;

    ②同源重組后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA的復制而穩定復制。

    3.2 技術特點或創新點

    3.2.1 本項目由于在CBH II上游加入不受葡萄糖抑制的真核啟動子PKI A,使CBH II不再受到培養基中葡萄糖影響,獲得高效表達,從而促進其他纖維素酶基因的協同表達,較大幅度提高菌株在發酵過程中的產纖維素酶的能力。

    3.2.2 幾乎所有已克隆的纖維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達。但是這一體系表達率低,產生的酶多數不能分泌到胞外。本項目成果使纖維素酶在原木霉宿主菌中獲得穩定高效表達,可以用于大規模培養及工業化生產。

    3.2.3 本項目對基因工程菌株的培養及產酶條件進行了摸索,嘗試進行液體培養基深層發酵,通過分段控制pH值、溫度和溶解氧進行發酵,發酵72小時左右酶活達到最高,為工業化大規模生產纖維素酶提供了參考。

    3.3 技術研制報告

    纖維素酶屬誘導型酶類其多個酶組分的表達調控是一個非常復雜的過程,其中CBH II具有關鍵的作用。據報道( Seiboth et al.1997),當CBH II基因缺失時,會影響纖維素酶系其它酶的表達,而缺失CBH I,EG III等基因時,只影響自身的表達。另有研究表明CBH II是木霉纖維素酶系統中最先表達的酶,其產物進一步誘導纖維素酶其他酶如CBH I,EG等酶基因的表達。而CBH II基因的表達又受到葡萄糖的抑制(Sternberg & Mandel,1979),因此要提高木霉的纖維素酶的產酶能力就可以通過木霉CBH II基因克隆,將其構建在不受葡萄糖抑制的真核啟動子下游如PKI,cDNA1等啟動子,使CBH II不再受到培養基中葡萄糖影響而得到高效表達,從而促進其他纖維素酶基因的協同表達,較大幅度提高菌株在發酵過程中的產纖維素酶的能力。

    由于木霉菌屬于半知菌,缺乏有性階段,對其雜交育種有一定困難。原生質體育種是一種非常有效的方法,木霉的轉化系統與其他真菌轉化系統相似,多為使用細菌來源的質粒構建的載體,在聚乙二醇(PEG),山梨醇和氯化鈣作用下把目的基因或DNA 片段引入受體原生質體,經過再生和選擇獲得轉化子。選用一個穩定的選擇標記對建立木霉轉化系統是非常必要的,木霉轉化的選擇標記包括營養缺陷型標記和顯性標記兩類。前者常用的如PyrG 或Pyr-4,后者常用的有HmR,benA,和amds。

    本成果采用先進的分子生物學技術,構建成功高活力纖維素酶工程菌體,超過國內目前使用的生產菌體的產酶能力,達到了國際先進水平。

    3.3.1供試菌種  綠色木霉G104中國科學技術大學生命科學學院基因工程實驗室保藏。

    3.3.2啟動子選擇  PKI A (0.4Kb)。

    3.3.3載體  pUT (9.2Kb) 中國科學技術大學生命科學學院基因工程實驗室構建,包含Ben A顯性標記。

    3.3.4培養基及培養條件  麥芽汁液體培養基pH 5.0,30℃,220r/min 培養24h。

    3.3.5試劑  pGEM-T-easy-vector Kit購自Promega 公司,Taq plus DNA polymerase       購自上海生工公司,限制性內切酶購自Promega 公司。

    3.3.6真菌總DNA 的提取

    ①離心收集菌體,加入400μl DNA 提取液(50mmol/L Tris-HCl,pH9.0;12.5mmol/L EDTA,pH8.0);

    ②充分振蕩后加入100μl 10%SDS及300μl氯化芐振蕩混勻,50℃保溫1h,每隔10min振蕩一次;

    ③加入50μl 3mol/L醋酸鈉,離心,收集上清,用異丙醇沉淀得到總DNA。

    3.3.7PCR擴增CBH II序列

    ①根據已知綠色木霉cDNA序列,設計PCR引物,由上海生工公司合成;

    ②PCR 擴增:用標準PCR反應體系進行PCR反應。

    PCR循環條件:預變性94℃3min,94℃ 變性50s,51℃ 復性50s,72℃ 延伸1min20s,35個循環后再延伸8min。

    3.3.8重組質粒載體pUT-CBH的構建

    ①用Gel extraction試劑盒從膠中回收PCR產物,得到約1.6Kb的CBH II片段,將其用Klenow酶補平后回收純化。

    ②將pUT質粒載體在多克隆位點用EcoR I限制性內切酶消化,產生的3’粘性突出末端用Klenow酶補平并將其回收純化,將上述兩個片段以合適的比例建立反應體系,轉化大腸桿菌DH5a,獲得重組質粒載體pUT-CBH。對篩選到的重組質粒用內切酶和PCR進行鑒定分析,所擴增的片段含有完整的CBH II序列。

    3.3.9重組質粒載體pUT-CE的構建

    將pUT-CBH質粒載體在用EcoR V限制性內切酶消化,產生的3’粘性突出末端用Klenow酶補平并將其回收純化,與PKI A片段以合適的比例建立反應體系,轉化大腸桿菌DH5a,獲得具有PKI A啟動子的重組質粒載體pUT-CE。

    3.3.10 pUT-CE重組質粒的轉化及重組菌的篩選

    將構建的重組質粒電轉化宿主菌G104,利用Ben A顯性標記進行初篩;而后進一步采用液體搖瓶培養檢測發酵液復篩,獲得一株表達量較高的重組菌,命名為G104-CE。

    3.3.11液體培養基深層發酵

    在10 L的通氣機械攪拌發酵罐中,接種量為10%,發酵過程采取分段控制pH值、溫度和溶解氧的工藝,發酵72h左右酶活力最高,實驗室樣品酶活力達到:液體3200u/ml。

    3.4 技術的先進性

    蛋白質基因同源重組技術是國家863計劃項目,863計劃項目在技術上均為國際領先或先進技術。基因重組纖維素酶菌株構建是863計劃蛋白質基因重組技術的延續。本項目采用的基因打靶技術是國際先進技術,纖維素酶的技術指標中熱穩定性高于國外同類產品水平。

    3.5 產品的技術性能、生產成本、銷售價格優勢

    由于本項目在菌株改造上采用了世界先進的基因重組技術,所生產的纖維素酶在技術及其它方面具有以下優勢:

    3.5.1 產品技術性能優勢

    第一、高活力。諾威信公司的同類產品酶活為2800u/ml,該公司產品的發酵液活力可達3200u/ml;

    第二、熱穩定性。美國杰能克公司產品的熱穩定性在55℃以下,該公司產品的熱穩定性可達85℃。

    3.5.2 生產成本優勢

    據了解,國外廠家2萬活力纖維素酶生產成本在12000元/噸以上,該公司的生產成本可控制在8000元/噸以下。

    3.5.4 價格優勢

    國外同類產品市場售價為4.6萬元/噸,可研及本報告中該公司產品出廠價為液態酶1.4萬元/噸,固態酶1.5萬元/噸。

    4、該重大關鍵技術的突破對行業技術進步的重要意義和作用

    4.1 提高酶制劑行業整體水平。該項目是我國第一個采用有自主知識產權的基因重組工程菌株進行產業化生產的項目,對提升我國酶制劑行業總體水平,提高我國酶制劑行業和國外企業的競爭能力具有積極的意義。

    4.2 基因重組纖維素酶菌株構建技術的成熟將對耐高溫糖化酶菌株構建及其它酶制劑的基因重組具有借鑒意義。

    4.3 采用具有自主知識產權的工程菌株進行產業化生產將對我國酶制劑行業的自主創新具有積極的示范作用。

三、項目建設方案

    1、建設規模

    根據吉林市的資源狀況、自然環境和市場調查情況,結合生產實際情況、建廠條件、資金情況、原輔材料供應等各種因素,該項目纖維素酶生產規模確定為年產15000噸。

    2、建設的主要內容

    2.1 項目建設組成表

序號

建(構)筑物名稱

建筑面積(m2)

層數

備注

1

原料處理間

592

4

2層

2

生產綜合樓

3749

4

新建

 

制種間

 

 

 

 

發酵車間

 

 

 

 

干躁車間

 

 

 

 

提取精制車間

 

 

 

3

包裝車間

906

4

3-4層

4

成品庫

906

4

1-2層

5

機(電、儀)修車間

150

1

新建

6

污水處理站

60

1

新建

7

鍋爐房

400

1

新建

8

車庫

300

1

新建

9

原輔材料庫

592

1

2層

10

地中衡

66

1

新建

11

蓄水池

800m3

 

新建

12

水處理站

100m3

 

新建

13

變電室

200m3

 

新建

14

綜合辦公樓

3254

4

1-2層

15

研發中心

5500

4

3-4層

16

中試中心

1184

4

3-4層

17

收發室

20

1

新建

18

廠區道路

1150

1

新建

19

廠區圍墻

700m

1

新建

20

電動大門

2扇

1

新建

21

廠區綠化

2200

1

新建


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